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灵芝的栽培与实验研究PDF,TXT迅雷下载,磁力链接,网盘下载

分类:教材发布时间：2018-09-17

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内容简介

《灵芝的栽培与实验研究》详细介绍了灵芝栽培的的主要品种、菌种的制作、人工栽培的模式及菌种脱毒、栽培料对灵芝主要活性成分的影响和灵芝覆土连作的障碍机制的实验研究。

作者简介

马红梅，1976年12月生，2004年毕业于华南农业大学，现工作于热带海洋学院，研究方向为应用微生物。

目　　录

第一篇灵芝的栽培
1灵芝的概况与常见品种（）
11营养类型及分布（）
12种类与分类状况（）
13主要成分及药理作用（）
14主要栽培品种（）
141赤芝(Glucidum)（）
142紫芝(Gsinense)（）
本章参考文献（）
2灵芝母种的制备（）
21培养基配制（）
211培养基配方（）
212培养基的制作流程（）
213PDA培养基制备方法（）

第一篇灵芝的栽培 1灵芝的概况与常见品种（） 11营养类型及分布（） 12种类与分类状况（） 13主要成分及药理作用（） 14主要栽培品种（） 141赤芝(Glucidum)（） 142紫芝(Gsinense)（） 本章参考文献（） 2灵芝母种的制备（） 21培养基配制（） 211培养基配方（） 212培养基的制作流程（） 213PDA培养基制备方法（） 22菌种的分离与培养（） 221组织分离法（） 222孢子分离法（） 223基质内菌丝分离法（） 本章参考文献（） 3原种和栽培种的制作（） 31培养基的选择与配方（） 311原种培养基的配方（） 312栽培种（代料栽培袋）培养基配方（） 32原种与栽培种生产工艺流程（） 321原种生产工艺流程（） 322栽培种生产工艺流程（） 33原种和栽培种生产技术要点（） 331配料（） 332拌料分装（） 333灭菌（） 334冷却（） 335接种（） 336培养（） 34栽培种（段木栽培种）制作（） 341段木的选择与处理（） 342段木规格及数量（） 343段木栽培袋制作（） 344接种（） 345菌棒质量鉴定指标与方法（） 346栽培季节（） 35菌种的感染与控制（） 351灵芝菌种感染杂菌的原因分析（） 352灵芝菌种感染杂菌的控制措施（） 本章参考文献（） 4灵芝的栽培与病虫害防治（） 41室内栽培（） 411栽培季节的选择（） 412栽培室的选建（） 413原料的选择（） 414发菌管理（） 415出芝管理及子实体的采集（） 416孢子粉收集（） 42室外大棚覆土栽培（） 421栽培场地设置及搭建荫棚（） 422接种（） 423菌丝培养（） 424排场（） 425出芝管理（） 43室外仿野生栽培技术（） 431品种选择（） 432场地建设的要求（） 433栽培模式（） 434林下覆土出芝及管理（） 435采收及采后管理（） 44病虫害防治（） 441病害防治（） 442虫害防治（） 本章参考文献（） 第二篇灵芝的实验研究 5灵芝菌体的物理脱毒研究（） 51研究概述（） 52研究方法（） 53研究意义（） 54实验方法与结果分析（） 541材料与设备（） 542实验方法（） 543结果与分析（） 544结论与讨论（） 本章参考文献（） 6灵芝菌体的化学脱毒研究（） 61研究概述（） 62研究方法（） 63研究意义（） 64实验方法与结果分析（） 641材料与设备（） 642实验方法（） 643结果与分析（） 644结论与讨论（） 本章参考文献（） 7椰糠栽培对灵芝三萜类化合物含量的影响（） 71研究概述（） 711灵芝栽培基质研究概述（） 712灵芝三萜类化合物研究概述（） 72研究意义（） 73实验方法与结果分析（） 731材料与设备（） 732实验方法（） 733结果与分析（） 734结论与讨论（） 本章参考文献（） 8灵芝连作障碍的自毒作用研究（） 81研究概述（） 811连作障碍研究概述（） 812自毒作用研究概述（） 82研究意义（） 83实验方法与结果分析（） 831材料与设备（） 832实验方法（） 833结果与分析（） 834结论与讨论（） 本章参考文献（） 9灵芝菌糠提取液对灵芝的化感作用（） 91研究概述（） 911植物的化感作用研究概述（） 912食用菌的化感作用研究概述（） 92研究意义（） 93实验方法与结果分析（） 931材料与设备（） 932实验方法（） 933结果与分析（） 934结论与讨论（） 本章参考文献（） 10连作土壤中的优势微生物种群对灵芝的化感作用（） 101研究概述（） 1011微生物与植物间的化感作用研究概述（） 1012食用菌与其他生物间的化感作用研究概述（） 102研究意义（） 103实验方法与结果分析（） 1031材料与设备（） 1032实验方法（） 1033结果与分析（） 1034结论与讨论（） 本章参考文献（）

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前　　言

前言
灵芝又称灵芝草、仙草，是一种珍贵的药食兼用的大型真菌，承袭三千年历代的经验和智慧，加上现代科学研究，灵芝于传统、生化、医药、学术上的地位已经十分明确。研究内容越来越丰富，研究成果刊载于各大学、医疗、研究机构等所出版的相关书籍、科学及医学等各类学术期刊和论文。
本书共分两个部分，第一篇主要介绍灵芝常规栽培，总结我们学院教学一线的教师总结和部分研究成果，也借鉴了其他灵芝研究者的研究成果，内容包括从栽培品种介绍、菌种制作、栽培技术与模式以及栽培管理过程中的病虫害防治等整个环节；第二篇为灵芝栽培过程中出现的问题而进行的实验研究，内容组织思路为：围绕菌种、栽培基质和栽培土壤而开展，包括菌种脱毒研究，灵芝栽培基质对灵芝产量与主要活性成分的影响及灵芝覆土连续栽培出现的连作问题。书中第八至第十章部分为海南省自然科学基金项目（项目编号：314082）的研究成果，第五和第六章部分为三亚市院地科技合作基金项目（项目编号：2015YD31）的研究成果部分内容，在此对参与这两个项目实验的同事和学生表示衷心的感谢，本书在撰写过程中参考了国内外大量期刊文献及部分网络资料，在此一并表示感谢。

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1灵芝的概况与常见品种
11营养类型及分布
灵芝(Ganoderma lucidum)在分类学上隶属于真菌门(Eumycota)，担子菌亚门(Basidiomycotina)，层菌纲(Hymenomycetes)，无隔担子菌亚纲(Holobasidiomycetes)，非褶菌目(Aphyllophorales)，灵芝科(Ganodermataceae)，灵芝属(Ganoderma)［1］，别名灵芝草、神芝、芝草、仙草、木灵芝、红芝、赤芝、瑞草、万年蕈等，是多孔菌科植物赤芝或紫芝的全株。

从灵芝获取营养的方式来分，灵芝既能以腐生的方式生长，也可以以寄生的方式生存。多数种类生长在阔叶树的腐木上，只有少数种类对树种的要求比较专一，例如闽南灵芝生长在松树桩上。有些种类有兼性腐生的习性，既能在活树上生长也能在死树上生长，如树舌灵芝。灵芝属的种类很少生长在地上，而假芝属的种类多数生长在地上，少数种类生长在腐朽树木、倒木或腐殖质上，很少生长在活树上［2］。从分布特征来看，灵芝科的种类多数生长在有散射阳光，树林较稀疏的地方或空旷地带。从生态因子来看，影响灵芝科在我国分布的主要因素是温度、湿度和光照及灵芝科物种腐生的宿主种类的分布［3］。我国灵芝类真菌自然分布的特点是东南多而西北少，主要分布在南方热带、亚热带范围内，尤其在海南品种特别丰富，雨量充足，气候炎热，生态环境优良，生物资源种类丰富，极其适合灵芝科真菌种类生长发育的要求［4］，是中国灵芝资源的宝库，甚至有其独有种类。《中华人民共和国药典》（2005年版一部）收录的灵芝是灵芝科的代表物种，其主要分布在欧洲、北美洲、亚洲（中国、朝鲜、韩国、日本、俄罗斯等），在我国主要分布在山西、山东、海南、浙江、福建、湖北、广西、广东、四川、贵州、云南等省（自治区）［5］。
12种类与分类状况

1灵芝的概况与常见品种 11营养类型及分布 灵芝(Ganoderma lucidum)在分类学上隶属于真菌门(Eumycota)，担子菌亚门(Basidiomycotina)，层菌纲(Hymenomycetes)，无隔担子菌亚纲(Holobasidiomycetes)，非褶菌目(Aphyllophorales)，灵芝科(Ganodermataceae)，灵芝属(Ganoderma)［1］，别名灵芝草、神芝、芝草、仙草、木灵芝、红芝、赤芝、瑞草、万年蕈等，是多孔菌科植物赤芝或紫芝的全株。 从灵芝获取营养的方式来分，灵芝既能以腐生的方式生长，也可以以寄生的方式生存。多数种类生长在阔叶树的腐木上，只有少数种类对树种的要求比较专一，例如闽南灵芝生长在松树桩上。有些种类有兼性腐生的习性，既能在活树上生长也能在死树上生长，如树舌灵芝。灵芝属的种类很少生长在地上，而假芝属的种类多数生长在地上，少数种类生长在腐朽树木、倒木或腐殖质上，很少生长在活树上［2］。从分布特征来看，灵芝科的种类多数生长在有散射阳光，树林较稀疏的地方或空旷地带。从生态因子来看，影响灵芝科在我国分布的主要因素是温度、湿度和光照及灵芝科物种腐生的宿主种类的分布［3］。我国灵芝类真菌自然分布的特点是东南多而西北少，主要分布在南方热带、亚热带范围内，尤其在海南品种特别丰富，雨量充足，气候炎热，生态环境优良，生物资源种类丰富，极其适合灵芝科真菌种类生长发育的要求［4］，是中国灵芝资源的宝库，甚至有其独有种类。《中华人民共和国药典》（2005年版一部）收录的灵芝是灵芝科的代表物种，其主要分布在欧洲、北美洲、亚洲（中国、朝鲜、韩国、日本、俄罗斯等），在我国主要分布在山西、山东、海南、浙江、福建、湖北、广西、广东、四川、贵州、云南等省（自治区）［5］。 12种类与分类状况 目前，世界上发现的野生灵芝品种有200多种，我国就有103种，分布在海南的就有80多种，占世界的40%。《本草纲目》上记载的灵芝等真菌有30余种，它是世界上有关灵芝等真菌最早的分类。《中国真菌志》记载，我国灵芝有98种，主要有赤芝、紫芝、薄盖灵芝、树舌灵芝、云芝等。而最早真正从分类学角度研究灵芝的是贾祖璋和周宗璜教授，他们于1935年各发表灵芝属1种。1939—1964年，邓叔群教授从事中国大型真菌的研究，在1964年撰写出版的《中国的真菌》一书中，记载了我国的灵芝属29种，其中灵芝属19种，假芝属10种。为我国灵芝的研究奠定了基础。戴芳澜教授在1987年出版的《中国真菌总汇》一书中，记载了中国的灵芝属26种，假芝属10种，共计36种。20世纪70年代以来赵继鼎教授进一步研究灵芝类真菌，并发表了大量新种和《中国灵芝新编》等专著。卫生部2001年发布的“可用于保健食品的真菌菌种名单”中，包括了灵芝、紫芝和松杉灵芝。目前民间应用与实验室研究开发的还有密纹灵芝、狭长孢灵芝、喜热灵芝、海南灵芝、内蒙古灵芝、紫光灵芝、拟热带灵芝、薄盖灵芝、热带灵芝、硬孔灵芝、有柄灵芝、层迭灵芝、鹿角灵芝、树舌灵芝、白皮壳灵芝、皱盖假芝等。灵芝品种的命名相对人为化，造成在灵芝生产和药物开发应用中，灵芝的种类和品种比较混乱，因而需要对灵芝不同种类和品种做一鉴别，以便减少同名异种、同种异名现象。现代灵芝属真菌分类学方法可以分两种：传统分类方法和现代生物技术分类方法。前者以灵芝形态学特征为主，但对灵芝各表型性状在分类上孰优孰重，各有主张。Haddow(1931)第一个应用皮壳构造来鉴定灵芝属的若干种。而Steyaert（1980)依据皮壳构造又把灵芝属分为4个灵芝亚属。但赵继鼎(2000)指出灵芝科同一种不同的标本上皮壳构造有可能变化，甚至在同一号标本中也有变化，过分强调这一特征在分类上的作用是不合适的［6］。在灵芝科担孢子方面,由于其担孢子具有特殊的构造,使其成为最可靠的分类依据，也是Donk(1948)建立灵芝科的唯一基础。但对于灵芝孢壁,各自说的部分概念并不一致，不过都应用两层壁的概念，即外壁和内壁。随着科学技术的发展和分子生物学的广泛应用，传统分类系统暴露出了一些缺陷和有待改进之处。例如，许瑞祥通过对从南美洲、北美洲、欧洲和亚洲地区采集的灵芝Glucidum进行rRNA基因的ITS核苷酸序列分析，发现在传统分类上这些样本学名都为Glucidum，但它们在rRNA基因ITS区域核苷酸序列存在差异，应分属于不同种［7］。同样他在松杉灵芝Gtsugae菌株间也发现存在同名异株现象。这充分说明传统分类方法具有一定的局限性。表型只是基因型的表达结果，而基因型表达的启动与关闭可能会受到外界因素的影响，导致表型与基因型会存在一定差距，如此则基于基因型的以生物学技术手段建立的分类系统——现代生物技术分类方法则应运而生，此法更能精确反映自然物种的本质联系与区别［8-9］。 13主要成分及药理作用 灵芝在生长过程中形成菌丝体、子实体及孢子。不同生长发育时期的菌体均含有丰富的营养成分和药理活性成分［10-14］。灵芝菌丝体含有多糖、多种氨基酸、活性肽、三萜类、碱基、核苷、硬脂酸、多种微量元素、苯甲酸、多种酶、酶抑制剂,以及多种生物碱等多种生物活性物质，并且菌丝体有富集作用，能将环境中稀有元素如硒、锗、碘的无机形式转化为有机形式,有利于人体吸收,这更增强了灵芝菌丝体功效。灵芝子实体含有多糖、氨基酸、蛋白质、多肽、甾类、萜类、有机酸挥发油、油脂、生物碱、长链烷烃以及多种酶和无机离子，腺嘌呤和腺嘌呤核苷，尿嘧啶和尿嘧啶核苷等，还含有K、Na、Ca、Mg、Mn、Fe、Cu、Zn、Cr、Co、Ni、Cd、Ge、Mc、B、P和I等多种元素。灵芝孢子粉有多种营养成分，孢子中的蛋白质含量高达18%，其中人体必需氨基酸中的异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸的含量非常丰富。维生素类主要是维生素E，另外也含有少量的维生素C。灵芝孢子中还富含多糖和寡糖，尤以二糖、三糖、四糖形式的糖类含量较高。脂肪酸类有二十四烷酸、硬脂酸、棕榈酸、二十二烷酸等。生物碱类有胆碱、甜菜碱和硫组氨酸甲基内胺盐。无机元素有钙、磷、铁、镁、钠、锌、硒等。灵芝作为拥有数千年药用历史的中国传统珍贵药材，具备很高的药用价值。灵芝药用作用的研究在我国有悠久的历史，在汉代《神农本草经》记载中，灵芝被认为具有“益心气，安精魂，补肝益气，坚筋骨”的作用，明代医学家李时珍在《本草纲目》中对灵芝的记载较为详尽，认为灵芝有“益心气，忍心生血，助心充脉，安神，益肺气，益脾气，补肝气，坚筋骨，利关节，治耳聋”等功效。现代灵芝的生物学、医学科研成果证明灵芝在许多方面对于人体的保健具有相当大的益处,也在一定程度上解释了《神农本草经》等古代文献对灵芝的药性、功能作用的论述。现代药理和临床研究证实，灵芝具有多方面生理活性和药理作用。据研究，灵芝具有保健和药用价值，如抗肿瘤、抗衰老、降血压等。灵芝产品在临床上被用于治疗高血压、冠心病、高血脂等已有较多报道［15-19］。中国老龄化严重，富贵病普遍，亚健康症状蔓延，国内至少有200 家以上企业从事灵芝研究和开发，产品繁多，至今已开发出了中药制品、美容用品、保健品、饮料等门类的系列产品［20-21］。市场上常见的有灵芝茶、灵芝冲剂、灵芝片、灵芝蜜饯、灵芝粉和灵芝孢子粉等。目前我国的灵芝制品，已远销日本、韩国、东南亚及我国香港、台湾，成为一些人每日必需的保健用品［22］。 14主要栽培品种 灵芝的种类较多，根据形态和颜色，可分为赤芝、黑芝、青芝、白芝、黄芝和紫芝6种，其中赤芝和紫芝为常见栽培药用品种。 141赤芝(Glucidum) 即通常所称的灵芝，实指灵芝的子实体而言。别名：红芝、灵芝草、吉祥蕈等。菌丝近无色至褐色，有分枝，多弯曲，直径15～6μm，壁厚无隔膜，无锁状联合。子实体为一年生，有柄、木栓质，菌盖肾形、半圆形、罕近圆形，有环状棱纹和辐射状皱纹，菌管长约1cm；管口面初期呈白色，每毫米间有4～5个。菌柄近圆柱形，侧生或偏生，粗2～4cm，长10～19cm，表面与盖面同色，或呈紫红色至紫褐色。盖面黄褐色至红褐色，有时向外渐淡，盖缘为淡黄褐色，有同心环带和环沟，并有纵皱纹，表面有油漆状光泽；盖缘钝或锐，有时内卷。菌盖及菌柄有红褐色油漆样光泽，菌盖背面污白色、淡黄色，孢子卵形或顶端平截，孢子粉褐色或灰褐色；孢子呈淡褐色至黄褐色，内含一油滴，卵形，顶端常平截，双层壁、内孢壁淡褐色至黄褐色，有突起的小刺，外孢壁平滑，无色。该种生长期短，是我国当前进行人工栽培的最重要种类，在灵芝科中其药用功效也是研究最深的。在赤芝中，优良品种有：信州、惠州、南韩、泰山1号、大别山灵芝等。其中信州灵芝，抗逆性强、菌盖大而厚、商品性好、产量高，是出口创汇的优良品种。南韩灵芝，发菌快、出芝早、片大整齐、产量较高。泰山灵芝，生长迅速、适合袋料栽培，但产量稍低。大别山灵芝，盖大色深，则更适合段木栽培。因此，各地要根据当地的生产条件(袋料或段木)、生产目的(出口或内销)来确定品种。采取袋料栽培，实现一年三收，则可选用南韩灵芝。此芝多生于柞、栎等阔叶树倒木或伐桩上，也偶见于针叶树倒木、伐桩上。分布在河北、山西、山东、江苏、安徽、浙江、江西、福建、台湾、湖南、海南、广西、贵州、四川、吉林及云南等地。 目前，赤芝栽培使用较多的品种如下：① G901赤芝，菌丝生长旺盛，抗逆性强，菌盖大而厚，芝大圆美，单生比例高，转潮快，灵芝和孢子粉产量高，适合段木栽培，是目前龙泉市主栽灵芝品种。②信州灵芝赤芝，抗逆性强，菌盖大而厚，单生，朵形完整，商品性能好，是出口创汇的优良品种。③泰山一号赤芝，生长快，菌盖大，柄较短，色泽好，产量高，袋栽良种。④ G8赤芝，菌盖平而大，柄粗短，菌盖比例高，色泽好，易栽培。⑤仙芝赤芝，柄较长，粗壮，芝形圆整，挺拔美观，趋光性强，是灵芝盆景选用的良种。 142紫芝(Gsinense) 其别名为紫灵芝、黑芝、中国灵芝、木芝。紫芝菌丝无色至深褐色，有分枝，直径17～52μm，无隔膜，也无锁状联合，壁较厚。子实体一年生，有柄，木栓质至木质，菌盖多数为半圆形至圆形、少数近圆形，具环形同心棱纹和辐射状棱纹，表面紫黑色至近黑色、紫褐色，有油漆样光泽，菌肉锈褐色。菌管管口与菌肉同色，管口圆形，每毫米约5个。菌柄侧生至偏生，细长呈圆柱形或略扁平，长可达15cm，直径约2cm，与菌盖同色或更深，很有光泽，皮壳构造呈拟子实层型，淡褐色至褐色，组成菌丝棍棒状，顶端膨大部分通常长25～3μm，宽4～65μm。菌肉锈褐色，孢子卵形或顶端平截，（10～125）μm×（7～85）μm，双层壁，外壁平滑，无色，内壁有明显的小刺，淡褐色。大型个体长宽可达20cm，一般个体47cm×4cm，小型个体2cm×14cm。紫芝的担孢子卵圆形，顶端脐突或稍平截，壁双层。外壁无色透明且平滑，内壁淡褐色并具明显小刺。扫描电镜下紫芝的担孢子大小为(1026～1105)cm ×(684～737)cm，表面有数条比较明显的环状波纹和纵向分布的沟峭，孢子近基部处有一疣状附属物。多生于阔叶树木桩旁地上或松木上，或生于针叶树朽木上。分布于河北、山东、江苏、浙江、江西、福建、台湾、广东、广西。 紫芝与灵芝两者在形态上有许多相似之处，两者在形态上区别主要为：紫芝菌盖表面呈紫褐色，紫黑色至近黑色，灵芝菌盖表面则呈红褐色，淡黄褐色至黄褐色；紫芝菌肉为褐色至栗褐色，灵芝菌肉为淡白色至白色；紫芝孢子较大而灵芝孢子较小。很多人误将两种不同的灵芝混为一谈。其实除形态的差别外，在口感上，两种灵芝也不同，赤芝较苦，紫芝味淡，苦味感较少。除两种灵芝外，现已经开发利用的品种有十余种，大多是灵芝属真菌，《中华人民共和国药典》（2000年版）认定了灵芝和紫芝干燥子实体是我国的法定中药材。本章参考文献 ［1］苏春丽.中国栽培灵芝菌株的遗传多样性研究及分子鉴定［D］.南京：南京农业大学,2006. ［2］陈体强,李开本.中国灵芝科真菌资源分类、生态分布及其合理开发利用［J］.江西农业大学学报，2004,26(1):89-95. ［3］林志彬.灵芝的现代研究［M］.北京:北京大学医学出版社,2007. ［4］吴兴亮,戴玉成.中国灵芝图鉴［M］.北京:科学出版社,2005. ［5］林树钱.中国药用菌生产与产品开发［M］.北京:中国农业出版社,2000. ［6］赵继鼎,张小青.中国真菌志第十八卷灵芝科［M］.北京:科学出版社,2000. ［7］许瑞祥.灵芝制品介绍及台湾研究现状［J］.食用菌,2001(增刊):276-280. ［8］王截.灵芝等九种食药用菌的种质资源分子鉴定［D］.福州：福建农林大学,2009. ［9］Chen Y G,Ji Y L,Yu H S,et al.A new Neotyphodium species from Festuca parvigluma Steud.grown in China ［J］.Mycologia,2009,101(5):681-685. ［10］周选围,林娟.中国野生灵芝资源的开发利用［J］.食用菌学报,1999,6(1): 58-64. ［11］陈国良,陈晓清.灵芝有效成分研究综述［J］.中国食用菌,2010,14(4):7-8. ［12］陈体强,周竞.灵芝浸膏微量元素与氨基酸测试分析简报.中国中药杂志,1994 19( 2): 9. ［13］何晋浙,蒉霄云,杨开.等.ICP-AES法分析灵芝中的微量元素［J］.光谱学与光谱分析,2009,29(5): 1409-1412. 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（3）马铃薯麦麸综合培养基：马铃薯（去皮）200g，麦麸100g，葡萄糖20g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁05g，琼脂20g，水1 000mL。 （4）马铃薯酵母粉综合培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，酵母粉4g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁05g，琼脂20g，水1 000mL。 212培养基的制作流程 材料选择→准确称量→加热提取→配制定量→分装→调pH值→灭菌（121℃、30min）→斜面摆放（培养基长度为试管长度的2/3）。 213PDA培养基制备方法 称取去皮、切片的马铃薯200g，置于锅内，加入水1000mL，煮至薯片软而不烂。用4～6层纱布过滤，取滤液。向滤液中加入琼脂20g，继续煮沸至琼脂完全融化，加入葡萄糖20g，补水至1000mL。趁热分装于试管中，装至试管长度的1/5～1/4，擦净管口，塞上棉塞或者硅橡胶塞。棉塞力求大小规范，松紧适中，不能出现缝隙。然后，在011MPa、121℃条件下灭菌30min。灭菌后趁热摆放斜放试管，根据实验室条件使用合适的工具使培养基前端蔓延至试管长度1/2，盖上纱布或灭菌的报纸（防冷凝水过多），待培养基凝固（静置24h）后，取3～5支试管置于30℃培养3d，若无杂菌出现，表明灭菌彻底，可供接种用。 22菌种的分离与培养 221组织分离法 灵芝子实体的不同成熟阶段及子实体的不同部位上，其细胞大小，内含物（原生质、细胞器）多少及分化程度是不同的。幼小的子实体和长大的子实体，其细胞数量相差很小，而细胞大小相差很大，成熟子实体的细胞明显大于幼小子实体的细胞。子实体长孢子前，细胞大，原生质含量较多。用这种细胞萌发的菌丝生命力强，抗性好。灵芝菌丝和子实体很容易纤维化，纤维化的细胞空腔很大，细胞质、细胞器含量比幼嫩子实体细胞还少。所以，灵芝组织分离时，灵芝的组织分离应该在子实体即将成熟的时候分离效果比较好。选取形态发育正常、刚开始开片，子实体刚出现橘黄（开始纤维化）、无病虫害、未弹射孢子的灵芝子实体，菌盖边缘尚在生长的黄白色子实体分离。分离部位应选在菌柄基部和菌盖边缘之间的中间部位，即选取在中部菌管的上方而不是选取在菌柄和菌盖交叉的位置。组织分离时所用割刀必须锋利，一刀割下就应把其分开，切忌反复用力撕拉，伤害组织。接种针火焰灭菌后要冷却后方可使用。接种块大小为03cm左右，不要太大，也不要太小。在无菌条件下用01%二氯化汞水溶液（升汞水）或用70%～75%酒精进行表面擦拭消毒。切去菌柄基部，在菌盖中部，用单面刀片或解剖刀切取米粒大菌肉一块置入新鲜的试管斜面培养基中央。可多分离一些试管，以供选择。试管置26～28℃恒温箱内，培养2～3d即可见菌肉上有少量白色棉絮状菌丝长出，7～8d后菌丝可长满斜面，选取灵芝菌丝生长旺盛、均匀、洁白的试管作为试验和生产用的菌种，通常称此为第一代母种试管，可保存在冰箱中供转管使用。 222孢子分离法 灵芝孢子粉是灵芝发育后期弹射释放出来的种子，生物学上称担孢子，集中起来后呈粉末状，通称为灵芝孢子粉，它的利用和研究是近几年来新发现的，每个灵芝孢子只有4～6μm，是活体生物，外被坚硬的纤维素外壁。它凝聚了是灵芝的精华，具有灵芝的全部遗传物质和保健作用。进行孢子分离时首先要取发育正常、健壮、已开始弹射孢子的灵芝子实体。切除菌柄，无菌条件下用01%升汞水或75%酒精进行表面消毒，用无菌水多次冲洗，再用无菌棉擦拭干净。将菌管朝下放在经灭菌的培养皿内，外罩以用75%酒精擦拭过的玻璃罩，在25～30℃条件下经过5～6h后孢子散落在培养皿底部，用接种针挑取少量孢子放入试管斜面培养基中部，移至培养箱中进行培养。分离用的培养基可采用普通马铃薯培养基、麸皮提取液培养基等。 孢子分离法污染率较高，应及时检查并去除被杂菌污染的试管。待孢子萌发出菌丝时，应连同少量培养基挑出及时移管。可将子实体切成蚕豆大的种块，用无菌铁钩固定后置三角瓶中，瓶底有1cm厚培养基，塞上棉塞。见孢子弹射后并萌发出菌丝时及时移管。野外分离灵芝孢子时因条件限制，可将菌肉（带菌管）贴在试管壁上，待孢子弹射入培养基后及时转管。孢子萌发后先形成一级菌丝，几天后便可形成二级菌丝。如果在显微镜下观察到锁状联合，一般即可确定为得到了灵芝菌丝。 223基质内菌丝分离法 利用灵芝生长的培养的基质作为分离材料获得灵芝菌种的一种方法，它仍属于无性繁殖，其优点是在灵芝子实体已衰老时仍可以获得灵芝纯菌丝体。但是，在子实体生长时，基质内的灵芝菌丝体不是单独存在的，常与多种微生物（如细菌、放射菌、霉菌及其他真菌）生长在一起，给分离增加了困难，且灵芝子实体生长时间较长，一年的春夏秋均会发生，取材比其他食用菌简单，且子实体存放时间较长，因此基内菌丝分离法在灵芝中很少应用。只有在进行灵芝资源调查，或选用野生种进行驯化时，灵芝子实体已释放完孢子和老熟无法进行孢子分离或组织分离的情况下才采用。为获得纯灵芝菌丝体，分离时注意分离材料的选择。选长有灵芝子实体，菇木尚未腐烂的作为分离材料，无裂褶和其他多孔菌等生长的枯木或树根，常用水冲洗去泥沙、杂质。摘去灵芝子实体，并从长子实体两边锯断，若芝木较粗用刀纵劈成数块。在无菌条件下，用75%酒精擦拭消毒，将带柄基部分置酒精灯火焰上燃烧，用手术刀削去表皮，每削一次均需燃烧1次，以防交叉感染，然后将长有白色菌丝的切削面切刮下微小的木片或颗粒，用接种工具移至新鲜的PDA培养基上，28℃下避光培养，见培养基中有白色菌丝生长并长满培养容器停止培养并保存。 3种方法分离得到菌丝体若要作为菌种使用，则要挑选灵芝菌丝体生长整齐，长速正常，菌丝外观饱满，长势旺盛，气生菌丝洁白、纤细、平坦、致密、均匀的分离物作为备用菌种。这种直接以野生分离灵芝菌种需经研究机构的栽培试验、成分分析，所以一般芝农若要进行生产经营应从具有较强科研技术实力、信誉良好的专门科研机构引种，或从灵芝经营专业公司引种比较可靠。本章参考文献 [1]池小妹.我国灵芝人工栽培技术研究现状[J].时珍国医国药，2005，16（8）：791-792

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